干草防腐剂和用于保存干草的方法与流程

来自 : www.xjishu.com/zhuanli/02/2015 发布时间：2021-03-24

本说明书涉及干草防腐剂。更具体地说，涉及用于保存在储存的高湿度干草中的干草(hay)的干草防腐剂以及使用干草防腐剂保存在储存的高湿度干草中的干草的方法。发明背景在打捆(或包装)(bale)前使干草在田间萎蔫至最佳湿度水平将是最佳的情况，以减少在干草打捆和储存期间的干物质(DM)损失、霉菌生长和植物细胞呼吸。然而，这种过程导致由于植物的持续呼吸引起的相当大的营养损失，由于机械破坏而引起的叶片损坏，和由于下雨引起的沥滤。认识到这一事实，并且由于天气条件的不可预测，已经导致许多干草生产者以高于最佳含水量(20-30％)的方式将干草打捆，以最小化雨水损害和机械叶片损失的风险。然而，这种做法会导致由于酵母和霉菌有时是细菌的活动而导致的损失，和由此导致的在喂养时干草的发热和不良营养品质。一种简单的方法是在储存时用有机酸(例如丙酸)喷洒潮湿的干草。虽然有机酸通常有效地防止潮湿干草中的真菌增殖，但是较高的施用率、增加的田间、处理成本以及环境考虑使大多数干草生产者不愿意使用它们。虽然研究表明，基于细菌的接种体可能潜在替代有机酸来保存高于最佳含水量的干草(Baah等人，Asian-Aust.J.Anim.Sci.18:649-660,2005)，但这与对青贮饲料和半干饲草的其它研究结果不一致(Zahiroddini等人，Asian-Aust.J.Anim.Sci.19(10):1429-1436,2006,Muck,Trans.ASAE47:1011-1016,2004)。有足够的证据表明，对接种体反应的明显不一致是由于个体接种体中的微生物物种与接种前干草上的附生微生物(细菌，酵母和霉菌)群体的相互作用引起的。非常需要提供改进的干草防腐剂，特别是用于防止和减少储存的高湿度干草中干草的热损伤以及保存所述干草的干燥防腐剂。技术实现要素：概述本公开提供了保存在储存的高湿度干草中的干草品质的方法。该方法依赖于使用能够防止和/或减少储存的高湿度干草中的热损伤的干草防腐剂。使用的干草防腐剂可以防止和/或降低高湿度干草中的热量，其效果等同或优于有机酸。在一方面，提供了用于防止和/或减少高湿度干草中的热损伤以及保存所述干草的干草处理方法，该方法包括向干草中加入干草防腐剂，所述干草防腐剂包含干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶，所述酶单独地包含在所述干草防腐剂中或与干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属(Pichia)的酵母或片球菌属(Pediococcus)的细菌组合。在另一方面，提供了用于防止和/或减少高湿度干草中的热损伤以及保存所述干草的干草处理方法，该方法包括向干草中加入干草防腐剂，所述干草防腐剂包含干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。另一方面，提供了用于防止和/或减少高湿度干草中的热损伤以及保存所述干草的干草处理方法，该方法包括向干草中加入干草防腐剂，所述干草防腐剂包含与干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属(Pichia)的酵母组合的干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。在另一方面，提供了用于防止和/或减少高湿度干草中的热损伤以及保存所述干草的干草处理方法，该方法包括向干草中加入干草防腐剂，所述干草防腐剂包含与干草防腐和减热有效量的片球菌属(Pediococcus)的细菌组合的干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。另一方面，提供了用于防止和/或减少高湿度干草中的热损伤以及保存所述干草的干草处理方法，该方法包括向干草中加入干草防腐剂，所述干草防腐剂包含干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属(Pichia)的酵母。在另一方面，提供了干草防腐剂，其包含干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。在另一方面，提供了干草防腐剂，其包含与干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属(Pichia)的酵母或片球菌属(Pediococcus)的细菌组合的干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。在另一方面，提供了干草防腐剂，其包含与干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属的酵母组合的干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。在一方面，提供了干草防腐剂，其包含与干草防腐和减热有效量的片球菌属的细菌组合的干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。在另一方面，所有前述方面可以进一步包含至少一种具有果胶裂解酶活性、葡聚糖酶活性或其混合活性的酶。另一方面，提供了包含干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属的酵母的干草防腐剂。在另一方面，提供了高湿度干草，其包含单独的或与干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属的酵母或片球菌属的细菌组合的干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶的酵母。高湿度干草还可以包含至少一种具有果胶裂解酶活性、葡聚糖酶活性或其混合活性的酶。另一方面，提供了高湿度干草，其包含干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属的酵母。附图说明已经总体上描述了本发明的性质，现在将参照附图(其以示例性的方式显示)、其优选实施方案进行说明，其中：图1示出了用毕赤酵母属的酵母(异常毕赤酵母(P.anomala))或至少一种具有壳多糖酶活性的酶(酶)处理的苜蓿干草捆在储存期间的每周平均温度；与用丙酸(Prop.Acid)处理和未处理的苜蓿干草捆进行比较；图2示出了用至少一种具有壳多糖酶活性的酶与干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属的酵母(PichChit)或片球菌属的细菌(Pediope)组合处理的苜蓿干草捆在储存期间的日平均温度，与用丙酸(PROP)处理和未处理的苜蓿干草捆进行比较；图3示出了用至少一种具有壳多糖酶活性的酶与毕赤酵母属的酵母(Pichia+Enz)或片球菌属的细菌(Pedio+Enz)组合处理的苜蓿干草捆在储存期间(2012年)中在40℃以上花费的时间(分钟)的图，与用丙酸(Prop.Acid)处理和未处理(对照)的苜蓿干草捆进行比较；和图4示出了用至少一种具有壳多糖酶活性的酶与毕赤酵母属的酵母(Pichia+Enz)或片球菌属的细菌(Pedio+Enz)组合处理的苜蓿干草捆在储存期间(2013年)中在40℃以上花费的时间(分钟)的图，与用单独的毕赤酵母属的酵母(Pichia)、片球菌属的细菌(Pedio)、丙酸(Prop.Acid)处理和未处理(对照)的苜蓿干草捆进行比较。详细描述高湿度干草的问题之一是由自发产生的热量引起的腐败和腐烂。这些加热的捆包通常颜色较差，营养价值较差，并且具有更可见的霉菌。一种方法是在储存时用有机酸(例如丙酸)喷洒潮湿的干草。虽然有机酸通常有效地防止潮湿干草中的真菌增殖，但是较高的施用率、增加的田间、处理成本以及环境考虑使大多数干草生产者不愿意使用它们。虽然研究表明，基于细菌的接种体可能潜在替代有机酸来保存高于最佳含水量的干草，但这与对青贮饲料和半干饲草的其它研究结果不一致。有足够的证据表明，对接种体反应的明显不一致是由于个体接种体中的微生物物种与接种前干草上的附生微生物(细菌，酵母和霉菌)群体的相互作用引起的。在最广泛的方面，本公开内容提供了保存干草品质并防止或减少储存的高湿度干草中的热损伤的方法，所述方法包括在有氧条件下用干草防腐剂处理新鲜干草。干草防腐剂包含干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。令人吃惊的是，已经发现，如果至少一种具有壳多糖酶活性的酶与毕赤酵母属的酵母或片球菌属的细菌组合使用，则干草防腐剂在防腐效果及其在防止和/或减少高湿度干草的热损伤的能力方面被进一步增强。当至少一种具有壳多糖酶活性的酶与毕赤酵母属的酵母或片球菌属的细菌组合时，与单独使用所述组合的每种组分相比，所述组合显著增强了高湿度干草的温度降低，如图4所示。或者，干草防腐剂可以包含单独的干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属的酵母。当本文中使用时，术语“干草防腐和减热有效量”将被理解为指至少足以保存干草品质的量。因此，该量至少足以防止和/或减少高湿度干草中的热损伤以及保存所述干草。在本文中使用的术语“干草”将被理解为所有形式的干草，因为该术语通常用于农业中。干草最常见的包括以低于20％的目标湿度水平收获的苜蓿、草或苜蓿和草的混合物。用于防止和/或减少高湿度干草中的热损伤以及保存所述干草的干草处理方法可包括向干草中加入干草防腐剂，所述干草防腐剂包含干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。如前所述，至少一种具有壳多糖酶活性的酶可以与毕赤酵母属的酵母或片球菌属的细菌组合。在一个实施方案中，用于防止和/或减少高湿度干草中的热损伤以及保存所述干草的干草处理方法可包括向干草中加入干草防腐剂，所述干草防腐剂包含与干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属的酵母组合的干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。在另一个实施方案中，用于防止和/或减少高湿度干草中的热损伤以及保存所述干草的干草处理方法可包括向干草中加入干草防腐剂，所述干草防腐剂包含与干草防腐和减热有效量的片球菌属的细菌组合的干草防腐和减热有效量的至少一种具有壳多糖酶活性的酶。或者，用于防止和/或减少高湿度干草中的热损伤以及保存所述干草的干草处理方法可包括向干草中加入干草防腐剂，所述干草防腐剂包含单独的干草防腐和减热有效量的毕赤酵母属的酵母。毕赤酵母属的酵母包括但不限于异常毕赤酵母的种(Pichiaanomalasp.)。在一个实施方案中，毕赤酵母属的酵母可以是具有登录号DBVPG3003菌株的异常毕赤酵母的所有鉴定特征的异常毕赤酵母的种。应当理解，包括了具有登录号DBVPG3003菌株的异常毕赤酵母的鉴定特征的任何分离株，包括具有本文所述的鉴定特征和活性的子培养物及其变体。具有登录号DBVPG3003株的异常毕赤酵母保藏于IndustrialYeastCollectionDBVPGoftheDipartimentodiBiologiaVegetaleeBiotecnologieAgroambientalieZootecniche,SezionediMicrobiologiaAgroalimentareedAmbientale,http//www.agr.unipg.it/dbvpg,UniversityofPerugia,Italy。片球菌属的细菌包括但不限于戊糖片球菌的种(Pediococcuspentosaceussp.)在一个实施方案中，片球菌属的细菌可以来自具有戊糖片球菌BTC328菌株(登录号为NCIMB12674)的所有鉴定特征的戊糖片球菌的种。在另一个实施方案中，片球菌属的细菌可以来自具有戊糖片球菌BTC401菌株(登录号为NCIMB12675)的所有鉴定特征的戊糖片球菌的种。应当理解，包括了具有戊糖片球菌BTC328或BTC401菌株的鉴定特征的任何分离株，包括具有本文所述的鉴定特征和活性的子培养物及其变体。具有登录号NCIMB12674和12675的戊糖片球菌菌株保藏在NationalCollectionofIndustrial,FoodandMarineBacteriaLtd,FergusonBuilding,25CraibstoneEstate,Bucksburn,AberdeenAB219YA。在该方法的一个实施方案中，干草的处理范围通常为每吨干草105至1015个活的酵母或细菌生物体，优选每吨干草107至1013个活的酵母或细菌生物体，更优选每吨干草109至1012个活的酵母或细菌生物体。当在本文中使用时，术语“吨”将被理解为指公吨(1000kg)。具有壳多糖酶活性的至少一种酶可以具有每吨待处理干草约6至约300酶单位(U)范围内的壳多糖酶活性。在一个实施方案中，壳多糖酶活性可以在每吨待处理的干草约6至约100U的范围内。一U定义为产生一定量的壳多糖酶活性的酶的量。每个酶单位(U)可以在pH6.0和2.5℃的温度下，在2小时测定中从壳多糖(g)每小时释放大约1.0mg的N-乙酰基-D-葡糖胺。根据本说明书的干草防腐剂还可包含至少一种具有果胶裂解酶活性、葡聚糖酶活性或其混合活性的酶。根据本说明书的干草防腐剂可以是液体或固体形式。根据本说明书的干草防腐剂可以包含合适的载体或原样使用。在固体形式中，干草防腐剂可以包含固体载体或物理增量剂。合适的载体可以是水性或非水性液体形式或固体形式。水性或非水性液体形式载体的非限制性实例包括水、油和石蜡。固体形式载体的非限制性实例包括有机或无机载体，例如麦芽糊精，淀粉，碳酸钙，纤维素，乳清，圆的玉米芯和二氧化硅。固体形式可以以轻撒粉剂的形式直接施加到干草上，或者如果它分配在液体载体中，则可以成功地喷洒在干草上。应当理解，可以使用用于本说明书目的的任何其它合适的载体。还应当理解，根据本公开内容的干草防腐剂可以使用本领域普通技术人员常用的标准技术应用于干草。干草防腐剂还可在打捆或包装之前、之中和/或之后施用。通过参考以举例说明本发明而不是限制其范围给出的以下实施例将更容易理解本发明。实施例实施例1：干草，处理和打捆条件干草是由90％的苜蓿和10％的雀麦草组成的第三切割物(third-cut)。干草于2011年9月17日用New-HollandTM圆盘器(disc-bine)切割，并保持无条件和不受干扰的干燥。在切割后5天，使用FarmexTM干草堆水分测试仪(1205DannerDrive，Aurora，OH)评估湿度水平，发现其范围在20至35％之间。此时，通过预先称重的接种体制备干草防腐剂，并将它们混合到含有6.5L预先测量的蒸馏水的单独的罐中并摇动1分钟。将喷雾器罐和具有单个喷嘴的喷杆安装在一个4790Hesston大方形打捆机上。放置喷杆使得喷雾模式以最小漂移覆盖90％的料堆。制作了两个试验捆包以确定对一个捆包完成施加添加剂的时间、捆包的重量以及打捆材料的含水量的更准确的测量。使用干草探针测定捆包湿度。发现制备一个捆包(0.91m×1.22m×2.44m)的平均时间为2分30秒，捆包平均重量为820公斤。异常毕赤酵母的施用率为每吨干草含1011CFU的1升。具有壳多糖酶活性的酶以每吨干草1.5g(悬浮在1L水中)的速率施用，相当于每吨干草约6U。丙酸产品由68％(vol/vol)丙酸组成，以2.72L/吨的速率施用，其被认为是阳性对照。阴性对照为水，以每吨干草1L的速率施用。异常毕赤酵母和具有壳多糖酶活性的酶从LallemandSpecialtiesInc.(Milwaukee，WI，USA)获得，而丙酸来自WausauChemicalCorporation(Wausau，WI，USA)。每次处理制备五个重复捆包。每次施用后采集异常毕赤酵母的样品，以验证生物体的生存力和数量。这是为了确认生物体的施用率。每个捆包在从打捆机中出来后使用喷漆立即标记，随后使用附接到捆绑带上的标签标记。所有捆包在打捆后一天称重并核心取样。在打捆后将所有捆包留在田间两个星期，以降低燃烧风险，然后将其运输并单层储存在侧面敞开的干草棚内。在第90天对捆包从四面(不包括捆包的顶部和底部)再次核心采样，并重新堆在顶部或其他(两个捆包的堆)上。在第180天再次采集核心样品。化学微生物测定对从田间六个不同部分收集的干草样品和从在储存的第1、90和180天在每个捆包上四个不同位置获得的复合核心样品进行了化学和微生物分析。McAllister等人概述的程序(1995.Intake,digestibilityandaerobicstabilityofbarleysilageinoculatedwithmixturesofLactobacillusplantarumandEnterococcusfaecium.Can.J.Anim.Sci.75:425-432)用于计数总细菌、乳酸生产菌(LAB)、酵母和霉菌。根据AOAC(1990)程序测定干物质(DM)、有机物质(OM)和粗蛋白质(CP)，以及中性洗涤剂纤维(NDF)、酸洗涤剂纤维(ADF)和酸洗涤剂不溶性氮(ADIN)，如VanSoest等人所述(1991.Methodsfordietaryfiber,neutraldetergentandnon-starchpolysaccharidesinrelationtoanimalnutrition.J.DairySci.74:3583-3597)。表1.在打捆时用各种干草防腐剂处理后90天干草的化学组成(％DM)、pH和微生物组成(cfulog10)。11PA＝异常毕赤酵母；CE＝具有壳多糖酶活性的酶；BPA＝丙酸；CON＝对照。2TB＝生长于营养琼脂上的非苛求细菌；LAB＝生长在MRS上被假定是乳杆菌的细菌；OM＝有机物质；NH3＝氨氮；TN＝总氮；LA＝乳酸；ADF＝酸性洗涤剂纤维；ADIN＝酸性洗涤剂不溶性氮表1显示了干草防腐剂处理对打捆后第0天(打捆日)和90天收集的干草样品的化学和微生物特征谱的影响。除了乳酸和酸洗涤剂不溶性氮(ADIN)之外，各种处理不影响评估的任何因素，即pH、总氮、氨氮和ADF。与其他处理相比，异常毕赤酵母处理中的乳酸浓度较低。与其他处理相比，异常毕赤酵母处理中的ADIN水平(％DM)较高。在第90天干草样品中，总细菌(营养琼脂上生长的非苛求细菌)、酵母和霉菌的群体不受处理影响。与其他处理方法相比，在异常毕赤酵母和对照捆包中，乳杆菌群体从打捆日的log103.80CFUg-1增加到在第90天的分别的log105.42和log106.29CFUg-1。表2.在打捆时用各种接种体处理后180天干草的化学组成(％DM)、pH和微生物组成(cfulog10)。11PA＝异常毕赤酵母；CE＝具有壳多糖酶活性的酶；BPA＝丙酸；CON＝对照。2TB＝生长于营养琼脂上的非苛求细菌；LAB＝生长在MRS上被假定是乳杆菌的细菌；OM＝有机物质；NH3＝氨氮；TN＝总氮；LA＝乳酸；ADF＝酸性洗涤剂纤维；ADIN＝酸性洗涤剂不溶性氮除了pH和酵母群体之外，180天样品中化学和微生物组成在处理之间没有差异(见表2)。与所有其他处理相比，在异常毕赤酵母中的pH最低(6.00)。在具有壳多糖酶活性的酶的处理中，酵母群体最高。表3.在打捆时用各种添加剂处理后90和180天干草核心样品中的挥发性脂肪酸(VFA)浓度1VFAPACEBPACON乙酸酯(gkg-1)90d8.958.5510.536.97180d9.699.588.387.28丙酸酯(gkg-1)90d0.13330.12670.4667a0.1467180d0.06750.0800.426a0.052总VFA(gkg-1)90d9.148.7211.047.17180d9.879.768.897.421PA＝异常毕赤酵母；CE＝具有壳多糖酶活性的酶；BPA＝丙酸；CON＝对照。现在参考表3，90天和180天样品中的总VFA(挥发性脂肪酸)和乙酸酯浓度都不受处理影响。储存180天后产生的主要VFA是乙酸酯，其占捆包中产生的总VFA的94％至98％。在存储180天后，用异常毕赤酵母和具有壳多糖酶活性的酶处理的捆包中，具有针对更高的乙酸酯和总VFA的趋势。在异常毕赤酵母和具有壳多糖酶活性的酶处理的180天捆包中，乙酸酯和总VFA的浓度比其他处理中的浓度至少高14％，表明这两种处理与其他处理相比都诱导了捆包中更大程度的厌氧微生物发酵。与对照处理相比，在异常毕赤酵母和具有壳多糖酶活性的酶处理的180天捆包中，总VFA和乙酸酯浓度高约32％。如预期的那样，丙酸处理捆包中的丙酸酯浓度在90天和180天样品中分别比其他处理中的浓度更高(表3)。表4.用各种添加剂处理并保存180天的干草的品质评估。PA＝毕赤酵母；CE＝具有壳多糖酶活性的酶；BPA＝丙酸；CON＝导致。颜色/气味-基于MarylandCooperativeExtensionFactSheet#644\'评价干草品质\'(http://www.extension.umd.edu/publications/pdfs/fs644.pdf)颜色具有鲜绿色的干草评分高(15至20)。金黄至黄色干草评5-12分深棕色至黑色干草评0至5分。气味新割下的干草的味道评分高(15至20分)。具有霉臭或其他臭味的干草评5至15分。腐臭或不寻常积尘的干草评分非常低(0到5分)评级评级基于检查者的整体评估，其中包括：非常差，差，平均，好，非常好，和优秀所有捆包在第180天打开，其品质根据MarylandCooperativeExtensionFactSheet#644进行评估。根据视觉和感官评估，对照和丙酸处理产生了最差品质的干草，而其余的处理产生平均至好品质的干草(表4)。温度稳定性通过使用打捆后第二天早晨插入核心孔中的三台DallasThermochroniButtons(EmbeddedDataSystems,Lawrenceburg,KY)连续测量每个捆包的内部温度来监测捆包的温度稳定性。iButtons配置为在存储期的头60天内每小时记录温度。因为温度读数显示没有进一步加热，所以探针在60天后没有放回捆包中。基于MarylandCooperativeExtensionFactSheet#644\'评价干草品质\'(http://www.extension.umd.edu/publications/pdfs/fs644.pdf)，在储存期结束时(180天)打开捆包并视觉评分腐败和霉菌程度。如图1所示，平均每周环境(捆包存储面积)温度从储存第一周的约16摄氏度的高点降至第7周之后的零度以下。然而，所有捆包中的温度在储存期的前三周内仍然保持高于20℃。在对照捆包中第二周内记录了最高的周温度(约34℃)。头三周内对照捆包的平均温度约为30℃。用具有壳多糖酶活性的酶处理的捆包中的温度在第1周至第7周一直低于对照捆包的温度(图1)。当将该处理与丙酸处理进行比较时，观察到类似的趋势(除了第2周之外)(图2)。虽然所有的处理对在储存期间降低干草的温度具有积极影响，但与对照和丙酸处理相比，具有壳多糖酶活性的酶是最有效的处理方法。与对照和丙酸处理的捆包相比，具有壳多糖酶活性的酶处理的捆包中的平均温度分别比同期对照和丙酸处理的捆包中的温度低6-8℃和4-5℃。动物实验在配有瘤胃套管并喂养了由50％梯牧草加50％的大麦青贮饲料(基于DM)组成的标准饲养场背景饮食的三只母牛中测定了180天干草样品的DM和NDF消失的原位速率和程度。将由相同防腐剂处理的捆包获得的180天核心样品的子样品混合并研磨以通过4mm筛网。将约4g的每个混合样品称重到涤纶袋中，并在每只母牛中一式三份孵育0、2、6、12、24、48、72、96和120小时。袋子由单丝聚酯网(53μm孔径，5cm×20cm，Ankom，Fairport，NewYork)制成。在开始孵育之前，奶牛被给予两周以适应饮食。孵育后立即将袋子在冷自来水中冲洗，直到袋子外面的所有瘤胃内容物都已被除去。袋子在家用洗衣机中在冷水中洗涤3分钟，使用无洗涤剂和自旋循环的精细洗涤循环。洗涤过程重复一次。将含有各处理样品的未孵育袋的重复集合与上述袋子一起洗涤，并用于估算每次处理的0小时消失。然后将所有袋子在强制空气烘箱中在55℃下干燥48小时。将在同一只母牛中孵育的相同处理的一式三份袋子中的残留物合并，并将其磨碎以通过1mm筛，然后按上述方法分析NDF。DM和NDF的百分比消失是由每个孵育时间后袋中剩余的比例计算的。将DM和NDF消失数据拟合至具有滞后期的Orskov和McDonald(1979)的指数模型的修改版本：p＝a+b(1-e-c(t-lag))，用于t lag其中，p是t小时后的DM或NDF消失(％)，a是快速消失的分数(％)，b是缓慢消失的分数(％)，c是分数b的分数消失率(h-1)。通过使用SAS(1990)软件包的迭代非线性程序(Marquardt方法)估算参数，基于假设的6％分数流出率估计孵育48小时的有效消失(EFFD，％)。表5.干草防腐剂1对新泽西母牛的瘤胃中孵育的苜蓿-雀麦草的原位DM消失(％)2的影响1PA＝异常毕赤酵母；CE＝具有壳多糖酶活性的酶；BPA＝丙酸；CON＝对照。2同一排中具有不同上标的平均值不同(P 0.05)。3由拟合方程计算的参数：p＝a+b(1-e-c(t-lag))，用于t lag；其中p是t小时孵育后的NDF从尼龙袋消失的比例(％)，a是快速消失的分数(％)，b是缓慢消失的分数(％)，c是分数b的分数消失率(h-1)。尼龙袋(insacco)干物质消失防腐剂对12,、24和48小时DM消失的影响包括消失的动力学如表5所示。DM消失中时间没有滞后时间。与对照和丙酸处理相比，用微生物添加剂(异常毕赤酵母)处理的干草样品在所有孵育时间点(12、24和48小时)具有更高的DM消失；48小时(这时所有添加剂(包括具有壳多糖酶活性的酶和丙酸)都高于对照)除外。类似地，与对照和丙酸处理相比，用微生物添加剂处理的干草样品中的速率和有效DM消失都更高。与所有其他处理方法相比，用异常毕赤酵母处理的捆包的干草样品的DM消失速率最快(0.114h-1)。在丙酸处理和对照中观察到最低的0.083h-1和0.087h-1的速率。除了具有与对照相似的值的具有壳多糖酶活性的酶外，所有添加剂都增加了潜在可消化的DM组分。尽管如此，用异常毕赤酵母处理的样品中的有效DM消失高于对照和丙酸处理。表6.干草防腐剂1对新泽西母牛的瘤胃中孵育的苜蓿-雀麦草的原位NDF消失(％)2的影响1PA＝异常毕赤酵母；CE＝具有壳多糖酶活性的酶；BPA＝丙酸；CON＝对照。2同一排中具有不同上标的平均值不同(P 0.05)。3由拟合方程计算的参数：p＝a+b(1-e-c(t-lag))，用于t lag；其中p是t小时孵育后的NDF从尼龙袋消失的比例(％)，a是快速消失的分数(％)，b是缓慢消失的分数(％)，c是分数b的分数消失率(h-1)。尽管处理之间在NDF消失率、快速消失分数和缓慢消失分数上没有差异，但与所有其他处理方法相比，用异常毕赤酵母处理的干草中的有效消失最高(表6)。在具有壳多糖酶活性的酶处理的干草中观察到NDF消失中最长的滞后时间(3.67h)，而在异常毕赤酵母处理中观察到1.89小时的最短滞后时间。后者的滞后时间与其他处理方法没有差别。在的异常毕赤酵母处理中，12、24和48小时的总NDF消失为具有壳多糖酶活性的酶处理的干草中的37.28％(最低)至异常毕赤酵母处理中的41.06％(最高)，其他处理具有中等值。在24小时消失中也发现了类似的趋势。与所有其他处理相比，具有壳多糖酶活性的酶的处理在48小时后的NDF消失最低。尼龙袋DM消失数据表明与对照相比异常毕赤酵母增加潜在的可消化级分以及干草的分数消失率和有效消失。实际上，异常毕赤酵母处理的干草的有效消失值优于对照和丙酸处理的值。实施例2：干草，处理和打捆条件干草是苜蓿干草，于2012年8月15日在FortMacleod,Alberta,Canada收获。苜蓿干草在田间萎蔫至约24％至约30％的湿度水平。按照实施例1测定捆包湿度。与具有壳多糖酶活性的酶的组合的异常毕赤酵母组合的施用率分别为每吨干草1L水中的1.5g和1011CFU。相应地，与具有壳多糖酶活性的酶的组合的戊糖片球菌组合的施用率为每吨干草1L水中的1.5g和1011CFU。丙酸产品由68％(vol/vol)丙酸组成，以2.72L/吨的速率施用，其被认为是阳性对照。阴性对照为水，以每吨干草1L的速率施用。根据实施例1在同一天对每个处理制备了约800kg的五个大圆捆包。在打捆后第0、90和180天收集所有处理的来自捆包的核心样品，以分析其营养价值，发酵产物和微生物变化。在打捆后第0和90、180天收集的核心样品进行微生物和化学分析。进行微生物分析以通过连续稀释在合适平板上来计数、分离和表征微生物(总细菌，酵母和霉菌)。表7在打捆时用各种干草防腐剂处理的苜蓿干草的微生物计数每个处理后的干草的微生物学特征在打捆时对于总细菌、酵母和霉菌是相似的，即使记录数值存在差异。在打捆90天后，与对照和丙酸处理相比，通过用与戊糖片球菌组合的具有壳多糖酶活性的酶的处理减少总细菌计数，而用与异常毕赤酵母组合的具有壳多糖酶活性的酶的处理倾向于具有降低的细菌计数。与对照和丙酸处理相反，对于使用与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合的具有壳多糖酶活性的酶的两个处理报告了酵母的数值降低。霉菌数量不受处理影响，除了在180天后通过丙酸处理减少了霉菌数量。进行化学分析以测定pH，DM，总氮，氨氮，NDF，ADF，酸洗涤剂不溶性氮(ADIN)，水溶性碳水化合物，挥发性脂肪酸(VFA)和乳酸(LA)。表8在打捆时用干草防腐剂处理后0、90和180天的苜蓿干草的化学组成具有壳多糖酶活性的酶与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合，具有壳多糖酶活性的酶与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合，具有壳多糖酶活性的酶与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合表9：在打捆时用不同干草防腐剂处理的苜蓿干草的发酵产物与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合的具有壳多糖酶活性的酶的处理对于干草发酵过程没有强烈的影响，因为这种饲料材料在发酵时没有倾向性。然而，用与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合的具有壳多糖酶活性的酶的处理在90天后具有较低的pH。在第180天收集核心样品，并使用原位和体外方法评估营养品质。进行了原位实验，以评估干草防腐剂对打捆后180天收集的干草样品的消化速率和程度的影响。使用配有瘤胃插管并喂养标准饲养场背景饮食的三只母牛。将每个处理的每个捆包(复制)的每个混合样品的约4g称重到涤纶袋中，并在每只母牛中一式三份孵育0、2、6、12、24、48、72、96和120小时。孵育后回收袋子并根据LRCSOP处理，以测定原位瘤胃DM和NDF消失。表11在打捆时用干草防腐剂处理的苜蓿干草的原位参数。a＝可快速降解的分数b＝可缓慢降解的分数c＝b降解所的速率(/h)lag＝滞后时间(h)表11中所示的原位数据显示用与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合的具有壳多糖酶活性的酶的处理的更易消化的干草材料。还进行体外实验以评估微生物接种体对180天干草样品的气体产生和动力学的影响。进行来自配有瘤胃插管并喂养标准饲养场背景饮食的三只母牛的混合的瘤胃液的两次运行。将每个处理180d干草的每个混合样品的约0.5g称入小瓶中并在每次运行中一式三份孵育，并测量气体3、6、9、12、24和48小时。孵育后回收小瓶并根据LRCSOP处理以测定体外瘤胃DM消失、气体产生、氨和VFA。表12在打捆时用干草防腐剂处理的苜蓿干草的体外消化率a＝渐近气体产量(mLg-1DM)c＝分数气体产率发酵率(mLh-1)lag＝滞后时间(h)在180天的干草的体外消化率和发酵能力证实了与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合的具有壳多糖酶活性的酶的两种处理的增强的消化率的原位结果。温度稳定性通过使用在收获后立即插入每个捆包内部的三(3)个DallasThermochroniButtons(EmbeddedDataSystems,Lawrenceburg,KY)连续测量整个储存期的内部温度来监测个体捆包的温度稳定性。以4小时的间隔记录温度10周。如图2所示，与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合的具有壳多糖酶活性的酶的处理在打捆后60天内均显示降低的平均温度。丙酸处理具有随时间过去最高的平均温度。如图3所示效果是特别显著的。图3显示了每次处理超过40℃的时间。由于这个温度被普遍认为是ADIN损伤的阈值，所以它说明了干草捆包的内部温度的强度。丙酸处理在40℃以上花费的时间最长。与戊糖片球菌组合的具有壳多糖酶活性的酶的处理在40℃以上花费的最短时间，随后是用与异常毕赤酵母组合的具有壳多糖酶活性的酶的处理，与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合的具有壳多糖酶活性的酶的两个处理均比对照在40℃以上花费的时间更少。总之，与对照和丙酸相比，具有壳多糖酶活性的酶与异常毕赤酵母或戊糖片球菌的组合在储存期中降低了干草捆包的内部温度、pH和总细菌数量。它们还增加了原位干物质消失(DMD)和消化速率以及体外DMD和气体产生速率。这可以通过这两种处理中较低的NDF和ADF含量来解释。实施例3本实施例表明，如果至少一种具有壳多糖酶活性的酶与毕赤酵母属的酵母或片球菌属的细菌组合，则具有壳多糖酶活性的酶在其防腐效果及其在防止和/或减少高湿度干草的热损伤的能力上被进一步增强。如实施例2那样，将干草收获并在田间萎蔫至湿度水平。与具有壳多糖酶活性的酶组合的异常毕赤酵母组合的施用率分别为每吨干草1L水中的1.5g和1011CFU。相应地，与具有壳多糖酶活性的酶组合的戊糖片球菌的组合的施用率为每吨干草1L水中的1.5g和1011CFU。单独的异常毕赤酵母的施用率为每吨干草1升中的1011CFU。单独的戊糖片球菌的施用率为每吨干草1升中的1011CFU。单独的具有壳多糖酶活性的酶以每吨干草1.5g(悬浮在1L水中)的比率施用。丙酸产品由68％(vol/vol)丙酸组成，以2.72L/吨的速率施用，其被认为是阳性对照。阴性对照为水，以每吨干草1L的速率施用。根据实施例1在同一天对每个处理制备了约800kg的五个大圆捆包。如实施例2所示，通过使用在收获后立即插入每个捆包内部的三(3)个DallasThermochroniButtons(EmbeddedDataSystems,Lawrenceburg,KY)连续测量整个储存期的内部温度来监测个体捆包的温度稳定性。以4小时的间隔记录温度10周。如图4所示，当至少一种具有壳多糖酶活性的酶与异常毕赤酵母或戊糖片球菌组合时，与使用该组合的每个组分相比，通过该组合令人惊奇地显著增强了高湿度干草的温度降低。实施例4试验目标。这项试验扩大了干草添加剂概念证明的开展，这将减少在挑战性收获条件(含水量比最佳值高下制备的捆包的加热)。它遵循使用实验室规模模型的类似试验。该测定遵循使用两种微生物(异常毕赤酵母或戊糖片球菌)与两种酶(纯的壳多糖酶或含有果胶裂解酶、葡聚糖酶和壳多糖酶活性的商业酶)的不同组合接种的小立方捆包(约25kg，79,9％DM)的温度特征谱。方法学。试验在苜蓿-草混合物(45：55)的小立方捆包上进行，收获时的平均重量为25.0kg。平均湿度水平为79.9％DM，在预期的干物质水平范围内(80-83％DM)。通过Dorhmann接种体涂抹器，在打捆机切割室前喷洒饲料后，用不同的处理接种捆包。实验设计允许应用对照和微生物添加剂的四种不同添加剂混合物(无，异常毕赤酵母+壳多糖酶，异常毕赤酵母+酶混合物，戊糖片球菌+壳多糖酶，戊糖片球菌+酶混合物)。对于每个处理，六个立方捆包被喷洒在两个捆包的三块中。将捆包运送到储存棚，称重并放置在货板上，以预定义的完全随机化模式和使得没有表面与另一个捆包接触的方式放置。每个捆包在其几何中心配有温度探头。捆包被储存了100天。结果。通常，接种异常毕赤酵母的处理(表13中的#2和3)显示出延迟捆包加热的效果，但是混合异常毕赤酵母和壳多糖酶(#3)显著延迟加热和捆包的温度高于环境温度5℃和10℃的时间(表13)。在400至600小时的温育期间，该处理也显示较低的温度。添加酶混合物与异常毕赤酵母菌株产生一些数值改善，虽然改善比壳多糖酶混合物较低。戊糖片球菌混合物(#4和5)允许捆包开始加热前的更长时间。使用这两种类型的酶均导致可比较的益处，高于环境温度10℃花费的时间减少(表13)。表13.处理描述和与温度特征谱有关的时间相关数据虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，其能够进行进一步的修改，并且本说明书旨在覆盖本发明的任何变化、使用或改编，一般来说这些变化、使用或改编遵循本发明的原理并且包括这样的与本公开内容的偏离，其来自本发明所属领域内是已知或习惯的实践，并且可以应用于上文所阐述的基本特征，并且在如下的所附权利要求的范围内。当前第1页1 2 3